Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий. Инструкция

Текст документа по состоянию на июль 2011 года


Утверждаю
Заместитель Начальника
Главного эпидемиологического
управления Минздрава СССР
Г.Г.ОНИЩЕНКО
30 октября 1990 г. N 15-6/42



Учреждения-разработчики: ЦНИИ эпидемиологии Минздрава СССР, Ленинградский ордена Трудового Красного Знамени НИИЭМ имени Пастера Минздрава РСФСР, НИИЭМ СО АМН СССР, Ленинградская городская санитарно-эпидемиологическая станция, Центральная противочумная станция Минздрава СССР.

Для специалистов санитарно-эпидемиологических станций, противочумной службы и бактериологических лабораторий лечебных учреждений.



1. ВВЕДЕНИЕ

В основу методических материалов и рекомендаций данной Инструкции положены результаты исследований, проведенных в течение многих лет в ЦНИИЭ, Ленинградском НИИЭМ им. Пастера и НИИЭМ СО АМН СССР - Всесоюзном центре по иерсиниозам и другими практическими и научными учреждениями, работающими по данной проблеме.

Обращается внимание эпидемиологов на усиление профилактических и противоэпидемических мер, направленных на предотвращение загрязнения иерсиниями пищеблоков, особенно организованных коллективов, в которых и формируется эпидемически неблагополучная ситуация. Указывается на повсеместный рост спорадической заболеваемости.

Предлагаются мероприятия, направленные на предупреждение загрязнения овощехранилищ.

Описывается лабораторная диагностика с использованием новых сред, испытанных в практике. Особое внимание уделено серологической диагностике.

Инструкция включает современные методы идентификации иерсиний, в том числе определение их вирулентных свойств. В связи с тем, что не все практические лаборатории располагают возможностями более тонких методов идентификации, предполагается выполнение их в республиканских или союзных центрах.

Инструкция призвана способствовать унифицированию методов исследования и идентификации возбудителя, а также улучшению диагностики иерсиниозов.



2. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

2.1. ИСТОЧНИКИ ИНФЕКЦИИ

Роль животных, носителей возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза как источников инфекции для человека, неравноценна. При иерсиниозе таковыми могут быть больные сельскохозяйственные животные (свиньи, коровы, овцы, козы). При псевдотуберкулезе эти животные в качестве источника инфекции практического значения не имеют.

От грызунов, обитающих в дикой природе, так же как и в антропогенных очагах, люди указанными иерсиниозами непосредственно практически не заражаются. Грызуны (больные или носители) выделяют возбудителей в окружающую среду и могут при этом инфицировать пищевые продукты. Обсеменение иерсиниями пищевых продуктов, преимущественно овощей, происходит при их хранении, транспортировке или технологической обработке в результате попадания на них частиц инфицированной иерсиниями почвы, в которой при определенных условиях (состав почвы, ее рН, влажность и т.д.) бактерии псевдотуберкулеза и иерсиниоза после выделения их животными способны размножаться и длительно сохраняться.

Человек при псевдотуберкулезе источником инфекции не является, при иерсиниозе больной или носитель при определенных условиях может заразить окружающих.



2.2. ПУТИ ПЕРЕДАЧИ

Основным путем передачи возбудителей псевдотуберкулеза и иерсиниоза является пищевой. С ним в большинстве случаев связаны спорадические и групповые заболевания. При иерсиниозе имеет место бытовой путь передачи от больных животных при уходе за ними и редко от человека - больного или носителя при тесном общении (мать - ребенок) или в условиях стационара.

В связи с известными фактами инфицирования иерсиниями воды в открытых водоемах нельзя исключить возможность водного пути передачи, но для его реализации, видимо, требуются особые условия.



2.3. ФАКТОРЫ ПЕРЕДАЧИ

В большинстве случаев непосредственной причиной заболевания является попадание иерсиний в восприимчивый организм с продуктами питания. Инфицирование пищевых продуктов возможно в местах их хранения и производства непосредственно или опосредованно (через загрязненную почву) от грызунов (псевдотуберкулез) или сельскохозяйственных животных (иерсиниоз). Обсемененность овощей не исключена в местах их выращивания в зоне природных очагов. Длительное содержание инфицированных овощей в хранилищах сопровождается накоплением на них иерсиний. Обсемененность овощей иерсиниями, особенно псевдотуберкулеза, возрастает в зимне-весеннее время. В этот период иерсинии выявляются на различных предметах окружающей среды и, в первую очередь, в контейнерах и таре для овощей. Однако и в весенне-летний период на овощах нового урожая, преимущественно капусте, а также огурцах, помидорах, луке зеленом и других летних овощах, в частности, выращенных в теплицах, поступивших в инфицированное хранилище, иерсинии также накапливаются.

Условия для обсеменения овощей и окружающей среды создаются не только в крупных овощехранилищах, но и в небольших складах при пищеблоках, а также в теплицах. Иерсинии выделяют с фруктов, в том числе цитрусовых, капусты квашеной, соленых огурцов, моркови.

Имеет место обсемененность иерсиниями (чаще энтероколитика) мяса рогатого скота и свиней, тушек кур, поверхности яиц и тары для них, а также молока на всем пути его производства. В отдельных случаях могут быть обсеменены как возбудителем псевдотуберкулеза, так и иерсиниоза хлебобулочные и кондитерские изделия (сухари, печенье и т.д.), которые нередко загрязняются выделениями грызунов.

Обсемененность различных продуктов иерсиниями определяет их значение как потенциальных факторов передачи. Наиболее значимы, особенно при псевдотуберкулезе, овощи. Занос возбудителей псевдотуберкулеза и иерсиниоза с овощами (зимними и летними) в пищеблоки при нарушении санитарно-гигиенического или технологического режимов его работы сопровождается быстрым инфицированием инвентаря и оборудования, которое используется для первичной обработки овощей, загрязняется также кухонная (терки, разделочные доски, ножи, емкости) и столовая (тарелки, чашки, столовые приборы) посуда; это приводит к обсеменению различных готовых блюд, в первую очередь овощных, в которых при относительно длительном хранении происходит накопление не только возбудителей, но и продуктов их метаболизма.

На практике в качестве факторов передачи при псевдотуберкулезе с наибольшей частотой отмечены салаты, содержащие капусту, морковь, репчатый лук, яблоки. При иерсиниозе - мясо, молоко и молочные продукты.



2.4. ХАРАКТЕРИСТИКА ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ

Заболевания людей псевдотуберкулезом и иерсиниозом регистрируются на всей территории Советского Союза. В районах с умеренным климатом эти инфекции выявляются в настоящее время значительно чаще, чем в сухих и жарких местах. Псевдотуберкулез и иерсиниоз проявляются в виде спорадической и групповой заболеваемости.

Спорадическая заболеваемость формируется за счет случаев, возникающих в семье или предприятиях общественного питания. В последние годы спорадическая заболеваемость той и другой инфекциями с постоянством регистрируется на всех территориях. Групповая заболеваемость характерна для псевдотуберкулеза. Она возникает на фоне спорадической и на отдельных территориях нередко преобладает над ней.

Вспышки могут быть распространенными, когда заболевания регистрируются в нескольких коллективах одного населенного пункта, и локальными, при которых заболевания отмечаются только в одном коллективе или в нескольких, но объединенных общим питанием.

По продолжительности вспышки могут быть разделены на кратковременные и длительные. Первые возникают внезапно, взрывообразно, быстро охватывают значительную часть коллектива (до 30% и более). По своей структуре они могут иметь различия в зависимости от сроков и кратности употребления инфицированного продукта.

При однократном инфицировании людей через блюда из сырых овощей и быстром устранении фактора передачи заболеваемость характеризуется резким подъемом и спадом в течение 5 - 8 дней. При повторном употреблении инфицированного продукта в течение 2 - 3 и более дней наблюдается несколько волн подъема заболеваемости. В том и другом случаях возможно появление поздних заболеваний за счет рецидивов и осложнений у людей с инапарантным течением заболевания в начале вспышки. Кратковременные вспышки чаще возникают в закрытых или полузакрытых коллективах (школы-интернаты, общеобразовательные школы, пионерские лагеря, детские сады и т.д.) с единым пищеблоком и общим фактором передачи. Вспышки "длительные" продолжаются иногда до 3-х месяцев с небольшими подъемами и спадами числа заболеваний и охватывают незначительную часть питающихся в одной или нескольких столовых. Они чаще возникают на предприятиях, в высших и средних учебных заведениях, где в столовых имеется более или менее разнообразный ассортимент блюд и несколько точек питания.

Заболеваемость псевдотуберкулезом и иерсиниозом распространена больше в городах и поселках городского типа. В значительно меньшей степени болеет сельское население.

Однако централизация питания в сельской местности сопровождается ростом заболеваемости псевдотуберкулезом и здесь.

Псевдотуберкулезом в основном болеют люди в возрасте от 2 до 50 лет. При этом уровень детской заболеваемости, как правило, выше, чем у взрослых. В отличие от псевдотуберкулезной инфекции при иерсиниозе дети до 2-х лет чаще вовлекаются в эпидемический процесс. При этом нередко в этой возрастной группе отмечается самый высокий показатель заболеваемости. Каких-либо особенностей в распределении заболеваний псевдотуберкулезом и иерсиниозом по полу нет. Имеющие место колебания показателей заболеваемости псевдотуберкулезом у лиц различных профессий в отдельные годы не обусловлены профессиональной принадлежностью, а являются следствием ситуации, складывающейся в системе снабжения продуктами в предприятиях общественного питания. В отличие от этого при иерсиниозе имеет место профессиональная заболеваемость животноводов.

Для псевдотуберкулеза характерны два подъема заболеваемости в феврале - апреле и в июне-июле.

При иерсиниозе увеличение числа случаев наблюдается в октябре-ноябре и весной.

Сезонные подъемы заболеваемости псевдотуберкулезом обусловлены употреблением овощей зимнего хранения, а в весеннее и летнее время тепличных культур и ранней капусты. Факторы, обуславливающие сезонность иерсиниоза, пока не ясны.



3. ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ И ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ

3.1. ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ

Органы Государственного санитарного надзора совместно с организациями, осуществляющими производство, хранение и реализацию продуктов питания, составляют планы по профилактике псевдотуберкулеза и иерсиниоза для каждой территории, которые являются разделами комплексных планов по профилактике острых кишечных инфекций, утверждаемых Исполкомом Советов народных депутатов и включаемых в план социально-экономического развития района, города, области, республики.

Предупредительный санитарный надзор осуществляется в полном объеме, предусмотренном санитарным законодательством. При этом акцентируется внимание на выполнение санитарно-гигиенических условий технологических процессов приготовления, хранения и реализации пищевых продуктов с разделением потоков сырья и готовых продуктов на всех этапах, а также обеспечением грызунонепроницаемости помещений.

Текущий санитарный надзор включает системы мероприятий, направленных на предупреждение контаминации иерсиниями пищевых продуктов как в процессе их централизованного хранения и производства, так и на всех этапах реализации населению, а также на предотвращение попадания и накопления микроорганизмов в готовые пищевые продукты на пищеблоках организованных коллективов и предприятий общественного питания.

3.1.1. Мероприятия, направленные на предупреждение контаминации иерсиниями картофеля, овощей и фруктов в местах их хранения и реализации.

Текущий санитарный надзор за плодоовощными базами, складами и хранилищами включает:

- контроль за подготовкой типовых и приспособленных овоще- и фруктохранилищ к приему на хранение нового урожая.

После освобождения овощехранилищ от зимних овощей они должны быть тщательно очищены от гниющих остатков и мусора. Особое внимание обращается на ликвидацию их грызунопроницаемости. Съемные части оборудования, стеллажи, инвентарь, тару следует просушить на открытом воздухе. За 3 - 4 недели до загрузки стены, пол овощехранилища и все находящееся в нем оборудование обрабатывают осветленным 3% раствором хлорной извести из расчета 500 мл на 1 кв. м поверхности с последующим (через сутки) проветриванием и побелкой помещений;

- контроль за обработкой и дезинфекцией тары плодоовощными базами перед отправкой ее поставщикам;

- контроль за санитарным состоянием плодоовощных баз и овощехранилищ, за своевременным освобождением их и прилегающих территорий от остатков овощей и производственного мусора;

- контроль за содержанием в удовлетворительном санитарно-техническом состоянием автомобильного и другого вида транспорта, предназначенного для перевозки картофеля, овощей и фруктов;

- наблюдение за численностью диких и синантропных грызунов и контроль за регулярным проведением дератизационных мероприятий проводится согласно "Методическим указаниям по борьбе с грызунами в населенных пунктах", утвержденным МЗ СССР 06.10.1981 за N 165-5, а также Приказу МЗ СССР N 60 от 17.01.1979 "О мерах по дальнейшему укреплению и развитию дезинфекционного дела" и "Временным методическим указаниям по борьбе с обыкновенными полевками на овощебазах", утвержденным МЗ СССР в 1984 году.

В ходе текущего надзора следует учитывать результаты работы Государственной инспекции по качеству сельхозпродуктов, осуществляющей:

- контроль за соблюдением температурно-влажностных режимов хранения, рекомендованных для овощей и фруктов;

- контроль за качеством проведения переборки овощей, зачистки кочанов капусты перед выдачей потребителям. Особое внимание обращается на качество продуктов, направляемых в детские дошкольные учреждения, школы, интернаты, в лечебно-профилактические учреждения, пищеблоки организованных коллективов и предприятия общественного питания;

- контроль за проведением тщательной очистки и промывки овощей перед засолкой и квашением, использованием для этих целей специально выделенных помещений, инвентаря и тары.

Исследования на обсемененность возбудителем псевдотуберкулеза картофеля, овощей, фруктов, солений, квашений, инвентаря, тары и оборудования хранилищ проводится СЭС, исходя из эпидситуации, но не реже 1 раза в квартал.

Плановый контроль за инфицированностью иерсиниями грызунов на объектах, связанных с хранением овощей, путем отлова их и бактериологического исследования проводится 1 раз в квартал отделами особо опасных инфекций СЭС и учреждениями противочумной службы. В случае обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза у грызунов, добытых на плодоовощной базе, проводится внеплановая дератизация. Возможность поставки хранящихся здесь овощей на пищеблоки организованных коллективов и предприятий общественного питания и употребления их в сыром виде (при соответствующей обработке) решается эпидемиологом в зависимости от конкретной ситуации.

В целях предупреждения заболеваемости псевдотуберкулезом и иерсиниозом, связанной с реализацией ранних овощей, следует осуществлять:

- раздельное хранение зимних и ранних овощей, для чего до поступления первых партий ранних овощей подготавливается отдельное складское помещение для кратковременного их размещения (очистка, дератизация, дезинфекция, побелка, просушка). Не допускается использование освободившихся секций овощехранилища без соответствующей подготовки;

- периодическое 1 раз в месяц полное освобождение хранилища от ранних овощей и проведение в нем дезинфекции 3% осветленным раствором хлорной извести. Обработанное таким образом помещение вновь используют для хранения ранних овощей;

- надзор за своевременной и полной реализацией ранних овощей;

- технологическую обработку теплиц, включая почву после сбора урожая, бактериологический контроль за обсемененностью иерсиниями овощей и оборудования в период сбора урожая.

В особо неблагополучных районах следует вводить раздельную реализацию торговой сетью ранних овощей и овощей зимнего хранения (картофель, репчатый лук и др.). При отсутствии таковой возможности организуется лотковая продажа летних овощей.

3.1.2. Мероприятия по предупреждению контаминации иерсиниями пищеблоков и готовых блюд.

Наиболее важным профилактическим мероприятием является постоянное слежение за общим санитарным состоянием стационарных и организуемых на период летнего отдыха пищеблоков. Эти мероприятия предусматривают:

- строгий контроль за санитарным состоянием и содержанием помещений и оборудования, предназначенных для разделки овощей, за обеспечением ежедневной обработки моющими средствами оборудования, инвентаря, применяемых для первичной обработки овощей;

- постоянный контроль за санитарным состоянием складских помещений, кладовых, овощехранилищ при пищеблоках, очистку и текущую дезинфекцию 1% раствором хлорамина данных помещений перед каждым завозом новой партии овощей;

- постоянный контроль за работой пищеблока, выполнением правил обработки столовой посуды, маркировкой инвентаря;

- борьбу с грызунами на всех пищевых объектах;

- тщательную переборку овощей, предназначенных для приготовления салатов;

- исключение использования для салатов свежей капусты, моркови и других овощей (очистка, мытье, повторное мытье перед использованием), запрещение хранения очищенных овощей в холодной воде;

- обязательное мытье фруктов, в т.ч. цитрусовых;

- соблюдение регламентированных сроков хранения готовых блюд.



3.2. ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ

При возникновении вспышки псевдотуберкулеза и иерсиниоза или при подозрении на данные заболевания среди членов коллектива (семьи) проводятся следующие противоэпидемические мероприятия:

- запрещение употребления всех видов овощей и фруктов без термической обработки до расшифровки и ликвидации групповых заболеваний;

- активное выявление больных и переболевших в коллективе и среди обслуживающего персонала с применением лабораторных методов обследования и учетом клинических проявлений;

- бактериологическое и серологическое обследование работников пищеблока для выявления больных и бактерионосителей;

- забор проб пищевых продуктов и смывов с различных объектов пищеблока;

- заключительная дезинфекция во всех помещениях пищеблока с обработкой инвентаря и оборудования 1% раствором хлорамина;

- бактериологическое исследование взятых на пищеблоке подозреваемых продуктов и готовых холодных блюд, а также смывов с инвентаря, оборудования, посуды пищеблоков и складских помещений, емкостей для отходов на иерсинии и другие бактерии семейства кишечных;

- тщательное мытье посуды моющими средствами в течение всего периода расшифровки и ликвидации вспышки;

- бактериологическое исследование смывов с овощей, инвентаря, оборудования плодоовощных баз и мест централизованного хранения овощей и фруктов, обеспечивающих район или коллектив, где возникла вспышка, с целью обнаружения циркуляции возбудителя и проведения санитарных мероприятий;

- обследование на наличие грызунов на пищеблоках и овощебазах, отлов и бактериологическое исследование грызунов;

- проведение внеплановых дератизационных мероприятий в случае обнаружения грызунов.

На территориях неблагополучных по заболеваемости псевдотуберкулезом и иерсиниозом, в детских организованных коллективах на период повышенной заболеваемости населения допускается запрещение употребления свежих овощей без термической обработки в виде салатов, винегретов и других блюд. Качественные ранние овощи (помидоры, огурцы, редис) могут быть тщательно вымыты и даны детям в целом виде.

Медицинское наблюдение за членами коллектива и обслуживающим персоналом проводится в течение 2-х недель с момента появления первых случаев заболевания (медицинский осмотр, термометрия). При наличии жалоб и клинических симптомов, характерных для иерсиниозов или других ОКЗ, больного изолируют и проводят лабораторное обследование. Дальнейшая тактика определяется результатами исследования и тяжестью клинического течения.

О сборе материала для лабораторного исследования и доставки его в лабораторию см. раздел 4.2.2 настоящей Инструкции.



3.3. ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ

В квартирных очагах эпидемиологическое обследование проводится при одновременном появлении нескольких случаев заболеваний, а также независимо от числа заболевших в период роста заболеваемости, когда не установлены пути и факторы передачи для постановки эпидемиологического диагноза. В остальных случаях необходимость обследования квартирных очагов определяется эпидемиологом с учетом эпидемической ситуации и данных ретроспективного анализа заболеваемости.

В организованных коллективах, имеющих отдельные пищеблоки, и на предприятиях общественного питания при появлении первых случаев псевдотуберкулеза или иерсиниоза вопрос о необходимости обследования решается эпидемиологом, за исключением детских коллективов, где обследование обязательно. При появлении повторных заболеваний или при возникновении групповой заболеваемости обследование проводится с участием специалистов соответствующего санитарно-гигиенического профиля.

В процессе эпидемиологического обследования:

- оценивается эпидемиологическая обстановка в очаге за 2 недели до возникновения заболеваний. Анализируется заболеваемость по датам, диагнозам, группам (классам, цехам и др.), посещаемости детей в учреждении. Учитываются такие диагнозы, как ОРЗ, краснуха, скарлатина, вирусный гепатит, ОКЗ, аллергические заболевания, узловатая эритема, лимфаденит, острый аппендицит;

- проводится подробный анализ характера питания за 2 недели до возникновения заболеваний псевдотуберкулезом или иерсиниозом для выяснения фактора передачи возбудителя инфекции. Изучают меню, меню-раскладку, бракеражные журналы, обращая внимание на овощи и овощные блюда, употребляемые в пищу без термической обработки, различные овощные добавки к салатам, закускам (лук зеленый, репчатый, соления, квашения и пр.), а при иерсиниозе также на молоко, молочные продукты, мясо, особенно свинину. Сопоставив сроки употребления продуктов, длительность инкубационного периода и посещаемость заболевшими соответствующего учреждения, можно предположить возможные сроки заражения и факторы передачи возбудителя;

- оценивается санитарно-гигиеническое состояние объекта. Дается характеристика пищеблока и его соответствие санитарным нормам, заселенность грызунами, наличие аварий водопроводной и канализационной систем. Устанавливают, откуда, когда, в каком количестве получены продукты, их качество, условия хранения на пищеблоке;

- оценивается технология приготовления пищи, особенно овощей, предназначенных в пищу сырыми (сроки хранения очищенных овощей, замачивание их в холодной воде, повторное промывание, ошпаривание кипятком непосредственно перед приготовлением), место хранения блюд и сроки хранения от приготовления до реализации, наличие необходимого набора помещений, оборудования, инвентаря, их маркировка;

- анализируется значение выявленных нарушений санитарно-гигиенического режима и технологии приготовления продуктов в возникновении заболеваний для возможной вторичной контаминации иерсиниями готовых блюд, компотов, хлебобулочных, кондитерских изделий и других продуктов.



3.4. ГОСПИТАЛИЗАЦИЯ БОЛЬНЫХ И ПОРЯДОК ВЫПИСКИ ИЗ СТАЦИОНАРА

Больные госпитализируются с учетом тяжести течения болезни.

При возникновении вспышек псевдотуберкулеза или иерсиниоза в закрытом учреждении (пионерский лагерь, детский дом, школа-интернат и др.) допускаются для больных легкими формами заболевания развертывание стационара на месте при условии обеспечения больных квалифицированной медицинской помощью, лабораторным обследованием и соблюдения противоэпидемического режима.

Бактерионосители подвергаются лечению в амбулаторных условиях без освобождения от работы.

Больных выписывают из стационара или после лечения на дому при клиническом выздоровлении.



3.5. ПОРЯДОК ДОПУСКА ПЕРЕБОЛЕВШИХ НА РАБОТУ И В ДЕТСКИЕ ОРГАНИЗОВАННЫЕ КОЛЛЕКТИВЫ

Работники пищевых объектов и лица, к ним приравненные, дети, посещающие детские учреждения, допускаются на работу и к посещению этих учреждений после выписки из стационара или лечения на дому на основании справки о выздоровлении. Дополнительных бактериологических обследований не проводится.

Бактерионосителей - работников пищевых предприятий на период амбулаторного лечения переводят на работу, не связанную с процессом приготовления пищи.

Дети, посещающие дошкольные учреждения, детские дома, школы, школы-интернаты, переболевшие псевдотуберкулезом или иерсиниозом, подлежат клиническому наблюдению с контролем температуры тела в течение 3-х недель.

Остальным категориям переболевших диспансерное наблюдение назначается по рекомендации врача стационара или поликлиники.

Дети-реконвалесценты освобождаются от профилактических прививок на 3 месяца. Срок освобождения от физкультуры определяется врачом в ходе наблюдения.



4. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Для успешного проведения лабораторного исследования необходимо знание биологических свойств возбудителей. Учитывая затруднения, нередко возникающие при дифференциации иерсиний с другими энтеробактериями, разделу идентификации выделяемых культур предпосланы некоторые современные данные о биологической характеристике иерсиний - возбудителей псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) и иерсиниоза (Yersinia enterocolitica).



4.1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЕРСИНИЙ

4.1.1. Морфологические свойства. Грамотрицательные палочки. При культивировании в жидких средах или при выделении из организма могут окрашиваться биполярно. Спор и капсул не образуют. У Y. pseudotuberculosis имеется 3 - 5, у Y. enterocolitica - множество жгутиков, расположены они перитрихиально. В мазках из бульонных культур клетки могут располагаться короткими цепочками.

4.1.2. Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. Оптимальная температура - 28 - 29 °С, могут размножаться при температуре от 2 до 40 °С. Подвижны при температуре 22 - 28 °С и неподвижны при 37 °С; у Y. enterocolitica подвижность более выражена. В условиях пониженной температуры (4 - 8 °С) культуры растут в гладкой форме, но накопление происходит медленно.

При температуре выше 28 °С Y. pseudotuberculosis диссоциирует в шероховатую (R) форму, при которой имеет место полиморфизм колоний по размеру, форме и цвету.

Диссоциация Y. enterocolitica в этих условиях выражена слабо. Как правило, при выделении из организма больного или от животных иерсинии обоих видов находятся в S-форме. Однако, иногда встречаются свежевыделенные культуры Y. pseudotuberculosis, находящиеся в R или переходной (SR или RS) формах. При культивировании Y. pseudotuberculosis на питательных средах, особенно при температуре выше 28 °С, подобные формы встречаются часто. Они растут на обычном агаре в виде более крупных неправильной формы, иногда суковатых колоний с неровными краями, а в бульоне образуют помутнение и осадок либо осадок и поверхностную рыхлую пленку с прозрачной надосадочной жидкостью. Образование шероховатых форм обычно сопровождается изменением или даже потерей S-антигена. Такие культуры часто дают неспецифическую, спонтанную агглютинацию.

Иерсинии хорошо растут на дезоксихолатном агаре, средах: Мак-Конки, Эндо, Серова и с бромтимоловым синим (БТС).

Среда Плоскирева, висмут-сульфит агар обладают ингибирующим действием на оба вида иерсиний, в связи с чем рост их колоний требует большего времени инкубации (не менее 5 суток).

Оба возбудителя способны расти на голодных средах (голодно-кислый агар, фосфатно-буферный раствор и др.). В жидких средах (МПБ, бульон Хоттингера, среда БКД) образуют равномерное помутнение. На плотных средах (МПА, агары Хоттингера, Эндо) через 24 - 48 ч образуют круглые полупрозрачные гладкие колонии размером от 0,1 до 1,0 мм (37 °С).

На плотной дифференциально-диагностической среде Серова Y. pseudotuberculosis растут в виде матовых колоний с неровными краями и выпуклым центром, размером от 0,2 до 2,0 мм. При взятии петлей они сдвигаются по поверхности агара. Сходную морфологию на этой среде имеют колонии Y. enterocolitica серовара 03. Колонии иерсиний других сероваров, как правило, полиморфны и отличаются по размеру, форме и консистенции.

На среде БТС через 24 - 48 ч иерсинии образуют круглые гладкие колонии голубого цвета, размером 0,1 - 0,2 мм через 24 ч и до 2,0 мм через 48 ч, с фестончатым краем и выпуклым центром на темно-голубом фоне среды. Иногда, особенно у Y. pseudotuberculosis, виден светлый голубой ободок. При взятии петлей колонии сдвигаются по агару.

4.1.3. Биохимические свойства. На среде Хью-Лейфсона ферментируют и окисляют глюкозу, не обладают цитохромоксидазой, не образуют сероводород (на железосодержащих средах), не разжижают желатин, не имеют фенилаланиндезаминазы, лизиндекарбоксилазы и аргинингидролазы, цитрат Симонса не утилизируют.

Y. pseudotuberculosis ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, галактозу, L-арабинозу, левулезу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, трегалозу, маннит, салицин; редуцирует нитраты, метиленовый синий; реакции на каталазу, уреазу и с метиловым красным положительны, Фогес-Проскауэра - отрицательна (при 26 - 28 °С и 37 °С); не ферментирует лактозу, сахарозу, рафинозу, целлобиозу, дульцит, инозит, сорбит, инулин, Д-арабинозу.

Y. enterocolitica ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу, сорбит, трегалозу; обладает уреазой и орнитиндекарбоксилазой; реакция с метиловым красным положительна, Фогес-Проскауэра положительна при 26 - 28 °С и отрицательна при 37 °С; не ферментирует: лактозу, рамнозу, рафинозу (есть лактозо- и рафинозоположительные варианты, чаще сероваров 05 и 07,8).

По биохимическим свойствам - ферментации ксилозы, салицина или эскулина, трегалозы, образованию индола различают 5 биоваров Y. enterocolitica (табл. 1). Близкородственными являются виды: Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii (Bergey's Manual, 1984).



Таблица 1



ОСНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА И ИЕРСИНИОЗА, ОТЛИЧАЮЩИЕ ИХ ОТ ДРУГИХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА КИШЕЧНЫХ

-----------+----------+--------------------+------+------+-----T-----+----T-----
¦ Тест или ¦Y. pseudo-¦ Y. enterocolitica  ¦Y.    ¦Y.    ¦Y.   ¦Y.   ¦Haf-¦Pro-¦
¦ субстрат ¦tuberculo-¦      Биовары       ¦frede-¦inter-¦kris-¦aldo-¦nia ¦teus¦
¦          ¦sis       +---+---T----+---T---+rikse-¦media ¦ten- ¦vae  ¦    ¦    ¦
¦          ¦     п    ¦   ¦  п¦   п¦  п¦   ¦nii   ¦      ¦senii¦     ¦    ¦    ¦
¦          ¦I - V     ¦ I ¦II ¦III ¦IV ¦ V ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
+----------+----------+---+---+----+---+---+------+------+-----+-----+----+----+
¦    1     ¦    2     ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5  ¦ 6 ¦ 7 ¦  8   ¦  9   ¦ 10  ¦ 11  ¦ 12 ¦ 13 ¦
+----------+----------+---+---+----+---+---+------+------+-----+-----+----+----+
¦Глюкоза   ¦+         ¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦+  ¦+     ¦+     ¦+    ¦+    ¦+   ¦+   ¦
¦Лактоза   ¦-         ¦-/+¦-  ¦-   ¦-  ¦-  ¦-/+   ¦-/+   ¦-    ¦-    ¦-   ¦-   ¦
¦Мальтоза  ¦+         ¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦+  ¦+     ¦+     ¦+    ¦-    ¦+   ¦в   ¦
¦          ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦ 1  ¦
¦Маннит    ¦+         ¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦+  ¦+     ¦+     ¦+    ¦+    ¦+   ¦-   ¦
¦Сахароза  ¦-         ¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦в  ¦+     ¦+     ¦-    ¦-    ¦-   ¦в   ¦
¦Рамноза   ¦+         ¦-  ¦-  ¦-   ¦-  ¦-  ¦+     ¦+     ¦-    ¦+    ¦+   ¦-   ¦
¦Сорбит    ¦-         ¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦-  ¦+     ¦+     ¦+    ¦+    ¦-   ¦-   ¦
¦Мочевина  ¦+         ¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦+  ¦+/-   ¦+/-   ¦+    ¦+    ¦-   ¦+   ¦
¦Реакция   ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦Фогес-    ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦Проскауэра¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦26 - 28 °C¦-         ¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦+  ¦+     ¦+     ¦-    ¦+/-  ¦+/- ¦-   ¦
¦37 °C     ¦-         ¦-  ¦-  ¦-   ¦-  ¦-  ¦-     ¦-     ¦-    ¦-    ¦+/- ¦-   ¦
¦Подвиж-   ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦ность     ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦26 - 28 °C¦+         ¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦+  ¦+     ¦+     ¦+    ¦+    ¦+   ¦+   ¦
¦37 °C     ¦-         ¦-  ¦-  ¦-   ¦-  ¦-  ¦-     ¦-     ¦-    ¦-    ¦+/- ¦+   ¦
¦          ¦         -+---+---+----+---+--¬¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦Салицин   ¦-/+      ¦¦+  ¦-  ¦-   ¦-  ¦- ¦¦+     ¦+     ¦-/+  ¦-    ¦-/+ ¦в   ¦
¦Индол     ¦-        ¦¦+  ¦+  ¦-   ¦-  ¦- ¦¦+     ¦+     ¦в    ¦-    ¦-   ¦в   ¦
¦Ксилоза   ¦+        ¦¦+  ¦+  ¦+   ¦-  ¦- ¦¦+     ¦+     ¦+    ¦-    ¦+   ¦в   ¦
¦Трегалоза ¦+        ¦¦+  ¦+  ¦+   ¦+  ¦- ¦¦+     ¦+     ¦+    ¦+    ¦+   ¦в   ¦
¦          ¦         L+---+---+----+---+---¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦          ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦   2  ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦Рост на   ¦-         ¦-  ¦-  ¦-   ¦-  ¦-  ¦+/-   ¦+/-   ¦-    ¦+    ¦-/+ ¦в   ¦
¦среде     ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦Симонса   ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
¦Фенилала- ¦-         ¦-  ¦-  ¦-   ¦-  ¦-  ¦-     ¦-     ¦-    ¦-    ¦-   ¦+   ¦
¦нин       ¦          ¦   ¦   ¦    ¦   ¦   ¦      ¦      ¦     ¦     ¦    ¦    ¦
-----------+----------+---+---+----+---+---+------+------+-----+-----+----+-----


Примечание: п - патогенные иерсинии; +/- - преобладает положительная реакция; -/+ - преобладает отрицательная реакция; в - вариабельный признак; 1 - положителен у P. rettgeri; 2 - положителен при 26 - 28 °С.



4.1.4. Антигенное строение и серологическая характеристика.

Y. pseudotuberculosis имеет жгутиковый (Н), 2 соматических (О) антигена - S и R, антигены вирулентности - V, W и другие, расположенные в наружной мембране и цитоплазме клетки, многие из них выражены только при 37 °С и в условиях ин виво.

Н-антиген термолабилен, диагностического значения не имеет.

По S-антигену различают 8 сероваров Y. pseudotuberculosis. Большинство штаммов, выделенных от людей, животных и из внешней среды, принадлежит к I серовару (60 - 90%), часть - к III (8 - 32%), единичные - ко II, IV, V (2 - 8%). О циркуляции в СССР иерсиний VI - VIII сероваров сведений нет.

О-антигены неоднородны по строению и состоят из нескольких компонентов, определяющих антигенные связи как между штаммами разных сероваров внутри вида, так и с другими энтеробактериями. R-антиген общий с R-антигеном чумного микроба. Общие антигены обнаружены с сальмонеллами групп В, Д и шигеллами.

Антигенные связи Y. pseudotuberculosis и большинства сероваров Y. enterocolitica слабые и выявляются лишь иммунодиффузионными методами. Более значительные антигенные связи имеют место у Y. pseudotuberculosis серовара I с культурами Y. enterocolitica сероваров 08, 018, 021.

Y. enterocolitica имеют жгутиковый (Н) и соматический (О) антигены. Обнаружены у них и антигены вирулентности, родственные антигенам Y. pseudotuberculosis, что обусловлено содержанием в клетках обоих возбудителей плазмиды вирулентности с мол. массой 40 - 48 мегадальтон.

Н-антигены вариабельны по строению, разрушаются при кипячении, активны в реакции агглютинации при температуре культивирования клеток 26 - 28 °С.

По О-антигену различают серовары: 01,2а,3; 02а,2в,3; 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 08; 09; 010; 013,7; 014; 015; 018; 019,8; 020; 021; 022.

Большинство штаммов, изолированных от людей, животных и из объектов внешней среды, выделенных на разных территориях, принадлежит к серовару 03 (30 - 60%), часть - к 05,27 (10 - 15%), 07,8 (5 - 10%) и 09 (1 - 30%), единичные - к другим 17 сероварам, циркулирующим повсеместно. Встречаются нетипируемые штаммы.

    В  составе  О-  и  Н-антигенов   содержатся   специфические  и
перекрестно-реагирующие  антигены,  определяющие  внутривидовые  и
общие для энтеробактерий  антигенные связи.  Они  выражены  внутри
вида и выявляются в РА у всех сероваров в титрах до 1:100 и  выше.
Наиболее выражены  антигенные  связи  у  иерсиний  серовара  09  и
бруцелл. Y. enterocolitica  сероваров  08,  014,  018,  021  имеют
общие антигены с сальмонеллами О-серогрупп: 27; 43   ;  55  и  66.
                                                  1,2
Антигенные связи имеют  место  с  шигеллами,  холерным  вибрионом,
протеями, гафниями.

4.1.5. Вирулентность для лабораторных животных.

К важнейшим патогенным свойствам Y. pseudotuberculosis относят: адгезивность и колонизацию; инвазивность и внутриклеточное размножение (в эпителиальных клетках, макрофагах), цитотоксичность и способность вызывать генерализованный инфекционный процесс. Основной моделью для определения вирулентности является энтеральное заражение морских свинок. В широкой практике с этой целью используют конъюнктивальное заражение морских свинок (т.н. кератоконъюнктивальная проба).

К важнейшим патогенным свойствам Y. enterocolitica относят: адгезивность и способность к колонизации на поверхности эпителиальных клеток, энтеротоксигенность, выраженную у большинства штаммов, а также инвазивность, установленную у штаммов патогенных сероваров. Основными моделями для определения вирулентности этих иерсиний являются: заражение культуры клеток Нер-2, тест на мышах-сосунках и энтеральное заражение морских свинок.

4.1.6. Патогенность для человека. Y. pseudotuberculosis I - V сероваров вызывают псевдотуберкулез. Возбудителем иерсиниоза на территории СССР являются Y. enterocolitica сероваров: 03 (биовар IV), 09 (биовар II), 05,27 (биовар III). Y. enterocolitica других сероваров и биоваров широко распространены в природе (особенно представители I биовара) и, как правило, не связаны с заболеваниями человека.



4.2. МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

С учетом биологии возбудителей псевдотуберкулеза и иерсиниоза бактериологическое исследование материала от больных, животных и объектов окружающей среды проводят с использованием одних и тех же сред накопления и плотных сред для их выращивания.

4.2.1. Среды, используемые для выделения иерсиний.

Жидкие среды накопления: фосфатно-буферный раствор - ФБР (Приложение 1), буферно-казеиново-дрожжевая среда - БКД (Приложение 2).

Плотные питательные среды: дифференциально-диагностическая среда Серова (Приложение 3), Эндо, среда с бромтимоловым синим - БТС (Приложение 4).

Комбинированные среды для первичной идентификации: Олькеницкого, Универсальный скошенный столбик - УСС (Приложение 5).

4.2.2. Материал для исследования и его обработка.

Для исследования используют различный материал от больных людей, животных и различных объектов внешней среды (табл. 2).



Таблица 2



МАТЕРИАЛ ДЛЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ, СПОСОБЫ ЕГО ЗАБОРА И ОБРАБОТКИ

----------------+------------------------+------------------------
¦    Материал   ¦ Количество для посева  ¦  Способ забора <*> и  ¦
¦               ¦    и сроки забора      ¦       обработка       ¦
+---------------+------------------------+-----------------------+
¦       1       ¦           2            ¦           3           ¦
+---------------+------------------------+-----------------------+
¦                    а) материал от больных                      ¦
¦                                                                ¦
¦Испражнения    ¦0,5 - 1,0 г в первые 6  ¦                       ¦
¦               ¦дней болезни и в период ¦                       ¦
¦               ¦обострения              ¦                       ¦
¦Моча           ¦Так же, как испражнения ¦Первая утренняя порция.¦
¦               ¦                        ¦После отстаивания      ¦
¦               ¦                        ¦использовать осадок    ¦
¦Мокрота        ¦0,5 - 1,0 мл (по        ¦Обычные                ¦
¦               ¦показаниям)             ¦                       ¦
¦Спинномозговая ¦0,5 мл (по показаниям)  ¦-"-                    ¦
¦жидкость       ¦                        ¦                       ¦
¦Кровь          ¦В первые три дня        ¦Из пальца или вены.    ¦
¦               ¦                        ¦Сгусток измельчить     ¦
¦Желчь          ¦1 - 2 мл (по показаниям)¦Обычные                ¦
¦                                                                ¦
¦                   б) операционный материал                     ¦
¦                                                                ¦
¦Мезентериальные¦1,0 - 1,5 г             ¦Измельчить             ¦
¦лимфоузлы      ¦                        ¦                       ¦
¦Участки        ¦1 - 2 г                 ¦                       ¦
¦кишечника      ¦                        ¦                       ¦
¦                                                                ¦
¦                    в) секционный материал                      ¦
¦                                                                ¦
¦Патологически  ¦1,0 - 1,5 г каждого     ¦Измельчить             ¦
¦измененные     ¦                        ¦                       ¦
¦органы         ¦                        ¦                       ¦
¦Содержимое     ¦Как испражнения больных ¦                       ¦
¦кишечника      ¦                        ¦                       ¦
¦Сгусток крови  ¦0,5 - 1,0 г             ¦-"-                    ¦
¦                                                                ¦
¦                 г) объекты окружающей среды                    ¦
¦                                                                ¦
¦Овощи          ¦10 штук каждого         ¦Смыв с поверхности на  ¦
¦               ¦                        ¦границе здоровой и     ¦
¦               ¦                        ¦пораженной части       ¦
¦Салаты, гарниры¦50 г                    ¦Суспензировать в 100 мл¦
¦               ¦                        ¦0,05% р-ра хлорида нат-¦
¦               ¦                        ¦рия, сеять 0,5 - 1,0 мл¦
¦               ¦                        ¦надосадочной жидкости  ¦
¦Рыбные, мясные ¦20 г                    ¦Растереть в 50 мл 0,05%¦
¦блюда          ¦                        ¦р-ра хлорида натрия,   ¦
¦               ¦                        ¦сеять 1 мл надосадочн. ¦
¦               ¦                        ¦жидкости               ¦
¦Творог, сыр,   ¦10 г                    ¦Как рыбные и мясные    ¦
¦масса, брынза  ¦                        ¦блюда                  ¦
¦Смывы с        ¦10 одноименных          ¦Смывы с поверхностей   ¦
¦оборудования   ¦поверхностей            ¦10 х 10 см             ¦
¦Молоко, компоты¦1 мл                    ¦5 мл среды             ¦
¦Вода           ¦500 мл                  ¦Фильтровать через вату ¦
¦               ¦                        ¦или обычный санитарно- ¦
¦               ¦                        ¦бактериологический     ¦
¦               ¦                        ¦фильтр                 ¦
¦                                                                ¦
¦         д) материал от животных (мелких млекопитающих,         ¦
¦             сельскохозяйственных, домашних) и птиц             ¦
¦                                                                ¦
¦Органы и ткани ¦1,0 - 1,5 г             ¦Измельчить             ¦
¦Испражнения    ¦0,5 - 1,0 г             ¦                       ¦
¦Кровь          ¦3 - 5 мл                ¦Сгусток из вены,       ¦
¦               ¦                        ¦измельчить             ¦
¦Кишечник       ¦1 - 2 мм                ¦В месте перехода тонкой¦
¦               ¦                        ¦кишки в толстую        ¦
----------------+------------------------+------------------------


--------------------------------

<*> Смывы и суспензирование материала проводить с использованием сред накопления.



4.2.3. Порядок бактериологического исследования.

Несмотря на невысокую эффективность прямого посева исследуемого материала на плотные питательные среды, его следует проводить при групповых заболеваниях. Для этих целей лучше применять среду Серова или БТС (на среде Эндо вырастает много посторонней микрофлоры).

Целесообразно использовать следующую схему.

Посев в среду накопления проводят после предварительной подготовки исследуемого материала. Внесенный в пробирки с 5 мл БКД или ФБР материал ставят в холодильник и выдерживают в нем при 4 - 8 °С 7 - 15 дней или до положительного высева.

Высевы на чашечные среды проводят на 2 - 3, 5 и 7-е сутки, а с ФБР - дополнительно на 10 - 15-е сутки. Высевы производят петлей (или стеклянной палочкой) из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают.

При использовании среды Эндо исследуемый материал можно предварительно подвергнуть щелочной обработке.

Методика щелочной обработки основана на относительной резистентности к щелочи иерсиний и чувствительности к ней других энтеробактерий. В лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций наливают по 0,2 мл свежеприготовленного щелочного раствора (Приложение 6) и бактериологической петлей диаметром 4 - 5 мм (или стеклянной палочкой) вносят материал из пробирок. Экспозиция (с момента внесения материала до посева) - не более 1 - 2 мин. Далее из каждой лунки делают высев на сектор чашки со средой Эндо. Инкубирование посевов при температуре 37 °С (или 26 - 28 °С) - 2 суток.

При посеве материала на среду Серова или БТС обработка щелочным раствором не требуется; высев делают на поверхность всей чашки; инкубирование при температуре 37 °С - 2 суток.

Просмотр посевов. На среде Серова просмотр проводят визуально или с помощью лупы. Возможен рост 2 типов колоний Y. pseudotuberculosis. Чаще встречаются мелкие, размером 0,2 - 2,0 мм, круглые с выпуклым центром колонии. Реже - относительно крупные (до 3 мм) неправильной формы с выпуклым центром. Колонии обоих типов имеют суховатую матовую поверхность. При снятии они сдвигаются по агару. Колонии Y. enterocolitica матовые с неровным краем, до 5 мм, с более плотной поверхностью и выпуклым центром. Колонии других видов кишечных бактерий на этой среде блестящие, большие, с неровным краем, обычно легко снимаются.

На среде Эндо просмотр колоний также производят визуально или с помощью лупы, через сутки-двое после посева.

Через 24 ч иерсинии обоих видов вырастают в виде мелких (0,3 - 0,5 мм), выпуклых, гладких, лактозонегативных колоний; к 36 - 40 часам они увеличиваются в размере, приобретая розовый оттенок.

Аналогичным образом просматривают посевы на среде БТС. Описание характерных колоний иерсиний на этой среде помещено в разд. 4.1.2.

Отсев. Характерные для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica колонии отсевают на среду Олькеницкого или УСС (Приложение 5). Одновременно с отсевом на полиуглеводную среду материал той же колонии высевают в пробирку со скошенным агаром или на чашку со слабощелочным питательным агаром.

4.2.4. Идентификация иерсиний. Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают по комплексу типичных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств.

Для дальнейшей биохимической идентификации отбирают бактериальные культуры, обладающие на среде Олькеницкого уреазной активностью (малиновое окрашивание), на УСС - окрашивающие среду в желтый или малиновый цвет (табл. 3).



Таблица 3



ОСНОВНЫЕ ПРИЗНАКИ ИЕРСИНИЙ И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ БАКТЕРИЙ НА ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫХ СРЕДАХ



Признаки

Y. en- tero- coli- tica

Y. frede- rik- senii

Y. in- ter- media

Y. kris- ten- senii

Y. pse- udotu- bercu- losis

Shi- gel- lae

Salmo- nellae

Es- che- ri- chia

Proteus

УСС

Столбик

желтый, по уколу черно-бурая полоска

малиновый

жел- тый

желтый или черный + газ

жел- тый + газ

малино- вый, верх черный

скошен- ная поверх- ность

желтая

малиновая

красная

жел- тая

желтая или ма- линовая

Среда Оль- ке- ниц- кого

Столбик

малиновый

жел- тый

желтый или черный + газ

жел- тый + газ

малино- вый или черный

скошен- ная поверх- ность

малиновая

красная

жел- тая

малино- вая



С чашек или "косяков" производят засев биохимического ряда. Инкубирование пробирок биохимического ряда проводят при 37 или 26 - 28 °С (при температуре 26 - 28 °С отмечается более стабильное выражение некоторых признаков). Пробирки с полужидким агаром (подвижность) и средой Кларка (реакция Фогес-Проскауэра) инкубируют при 37 и 26 °С.

В таблице 1 приведен минимальный набор биохимических тестов, позволяющий дифференцировать Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica 5 биоваров, другие виды иерсиний, а также микроорганизмы, имеющие сходство с иерсиниями.

Для идентификации Y. pseudotuberculosis и дифференциации их от других энтеробактерий можно применять поливалентный псевдотуберкулезный бактериофаг. Пробу ставят на плотной питательной среде при температуре 20 - 22 °С, нанося цельный или разведенный фаг каплями или дорожкой на сплошной посев "газоном".

Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к видам Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле (методика общепринятая) с диагностическими сыворотками к Y. pseudotuberculosis (поливалентная к I - V сероварам и моновалентные к I и III сероварам) и к Y. enterocolitica наиболее распространенных сероваров (03; 09; 05,27; 08; 07,8; 04,32; 05; 013,7).



4.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ

4.3.1. Определение вирулентности Y. pseudotuberculosis <*>. Методика постановки кератоконъюнктивальной пробы.

--------------------------------

<*> Рекомендуется для Центра по иерсиниозам и его филиалов, а также специализированных лабораторий.



    Для постановки кератоконъюнктивальной пробы используют морских
свинок массой 200 - 300 г. Заражение проводят  суточной  культурой
свежевыделенных штаммов иерсиний псевдотуберкулеза, выращенных  на
агаре Хоттингера. В  конъюнктивальную  полость  бактериологической
                                                         9
петлей диаметром 2 - 5 мм вводят бактерии в  дозе  1 х 10  -  1  х
  10
10  . Для  каждого  штамма  используют  не  менее  двух  животных,
заражая у них один  глаз  (второй  служит  контролем).  Для  этого
левой  рукой  морскую  свинку  фиксируют  на поверхности стола,  а
правой с помощью петли вводят  культуру  под  приподнятое  верхнее
веко и  осторожными  движениями  петли  распределяют  культуру  по
своду конъюнктивы. После этого извлекают петлю из конъюнктивальной
полости,  веки  зараженного  глаза  смыкают  на  1 мин.,  а  петлю
стерилизуют   в   пламени   спиртовки.   Животных    содержат    в
индивидуальных банках или клетках.  Ежедневно  в  течение  недели,
начиная со второго дня,  оценивают  изменения  слизистой  оболочки
глаза.

Можно ограничиться внимательным осмотром состояния конъюнктивы (век, склеры, свода) и роговицы, освещая глаза настольной лампой. Удобнее использовать две лупы (с увеличением в 2 - 4 раза), фиксируя одной из них свет от настольной лампы на глаза животного, а через вторую поочередно рассматривать контрольный и зараженный глаз при раздвигании век. На каждую пробу заполняют протокол, регистрирующий выраженность признаков конъюнктивита (сужение глазной щели, гиперемия конъюнктивы, отек век, наличие и характер отделяемого конъюнктива) и состояние роговицы, оцениваемых крестами (табл. 4).



Таблица 4



КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ КОНЪЮНКТИВИТА И КЕРАТИТА

-------------+--------------+-------------+-----------------------
¦  Симптомы  ¦Незначительные¦  Умеренные  ¦     Выраженные       ¦
¦            ¦     (+)      ¦    (++)     ¦        (+++)         ¦
+------------+--------------+-------------+----------------------+
¦Сужение     ¦На 1/3        ¦На 1/2       ¦Полное                ¦
¦глазной щели¦              ¦             ¦                      ¦
¦Гиперемия   ¦Легкое        ¦Выраженное   ¦Разлитая с инъекцией  ¦
¦конъюнктивы ¦покраснение   ¦покраснение  ¦сосудов               ¦
¦Отек век    ¦На 1 мм       ¦На 2 мм      ¦Более 2 мм            ¦
¦(утолщение) ¦              ¦             ¦                      ¦
¦Отделяемое  ¦Прозрачное или¦Мутное на    ¦Обильное серозно-гной-¦
¦конъюнктивы ¦мутноватое,   ¦веках и в    ¦ное или гнойно-творо- ¦
¦            ¦скудное в углу¦углу глаза   ¦жистое, часто со      ¦
¦            ¦глаза         ¦             ¦склеиванием век       ¦
¦Помутнение  ¦Очажки        ¦Диффузное    ¦Белая, толстая тусклая¦
¦роговицы    ¦голубоватой   ¦голубое      ¦роговица, часто с     ¦
¦            ¦опалесценции  ¦помутнение   ¦пленками налетов      ¦
-------------+--------------+-------------+-----------------------


Незначительная выраженность конъюнктивита через 2 - 3 суток после заражения и отсутствие его прогрессирования или даже затухание через 5 - 7 дней, отсутствие или слабая выраженность кератита через 2 - 3 суток, без прогрессирования или даже с исчезновением помутнения роговицы через 5 - 7 дней, характеризуют слабую вирулентность штамма. Более выраженный и прогрессирующий к 5 - 7 суткам конъюнктивит при незначительном непрогрессирующем помутнении роговицы расценивается как умеренная вирулентность штаммов. Прогрессирующие конъюнктивит и кератит, характеризующиеся обычно склеиванием изъязвленных век, обильным гнойным или гнойно-творожистым эксудатом, интенсивным помутнением роговицы, свидетельствуют о высокой вирулентности штаммов. Примеры оценки приведены в таблице 5.



Таблица 5



ОЦЕНКА ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ ИЕРСИНИЙ ПО СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ КОНЪЮНКТИВЫ И РОГОВИЦЫ МОРСКИХ СВИНОК

---------------+--------------------------------------------------
¦   Степень    ¦        Выраженность и развитие изменений        ¦
¦вирулентности +------------------------+------------------------+
¦   штаммов    ¦      конъюнктивит      ¦        кератит         ¦
¦              +-----------+------------+-----------+------------+
¦              ¦2 - 3 суток¦5 - 7 суток ¦2 - 3 суток¦5 - 7 суток ¦
+--------------+-----------+------------+-----------+------------+
¦Слабо         ¦+          ¦от - до +   ¦от - до +  ¦ -          ¦
¦вирулентные   ¦           ¦            ¦           ¦            ¦
¦Умеренно      ¦от + до ++ ¦++          ¦+          ¦ +          ¦
¦вирулентные   ¦           ¦            ¦           ¦            ¦
¦Высоко        ¦от + до ++ ¦до ++       ¦от + до ++ ¦от ++ до +++¦
¦вирулентные   ¦           ¦            ¦           ¦            ¦
---------------+-----------+------------+-----------+-------------


Свежевыделенные штаммы Y. pseudotuberculosis закономерно вызывают кератоконъюнктивит различной выраженности, коррелирующий с изменениями во внутренних органах, что отражает степень их вирулентности.

4.3.2. Определение маркеров вирулентности иерсиний.

    Вирулентные иерсинии содержат в клетках специфические молекулы
плазмидной ДНК (плазмиды  вирулентности),  гены  которых  кодируют
синтез  дополнительных  белков,   обусловливающих   взаимодействие
бактерий с  чувствительными  клетками  хозяина,  резистентность  к
бактерицидному действию сыворотки крови, а также ряд культурально-
морфологических  и  других  особенностей:  зависимость  роста   от
  ++
Са  ,  способность  к  аутоагглютинации,  зависимость   морфологии
колоний от температуры, поверхностная  гидрофобность  клеток.  Эти
                                                                +
признаки являются маркерами  вирулентных  плазмидосодержащих  (П )
иерсиний.


Методика определения способности к аутоагглютинации

    Для посева используют свежевыделенные чистые культуры иерсиний
(со скошенного  агара,  полиуглеводной  среды)  или  изолированные
колонии. В две пробирки со средой Кларка (Приложение  7)  засевают
  6     8
10  - 10  клеток. Одну пробирку инкубируют при температуре 37  °С,
другую - при 26 - 28 °С в течение 24 - 48 ч.

Положительный результат заключается в образовании рыхлого хлопьевидного осадка и прозрачной среды в пробирке, инкубированной при температуре 37 °С, при равномерном помутнении и небольшом компактном осадке во второй пробирке, инкубированной при температуре 26 - 28 °С. У псевдотуберкулезного микроба возможно образование хлопьев в обеих пробирках. При отрицательном результате в обеих пробирках отмечается равномерное помутнение среды, хлопья отсутствуют.

При нечетком положительном результате проводят выделение плазмидосодержащих клонов, которое возможно, например, в ходе определения кальцийзависимости роста.



Методика определения кальцийзависимости роста

    Свойство кальцийзависимости проявляется  в  ограничении  роста
                                                        ++
(бактериостаз), наступающем в условиях дефицита ионов Са   в среде
при температуре 37 °С.

Для посева используют культуру, выросшую при температуре 22 - 28 °С (например, на среде Кларка), которую в одинаковой дозе (100 - 500 м.к.) равномерно распределяют по поверхности кальцийдефицитной среды (Приложение 8) в двух чашках, одну из которых инкубируют при температуре 37 °C, другую - при 26 - 28 °С в течение 48 ч.

    При положительном результате колонии, выросшие при температуре
37 °С, значительно мельче,  чем при 26 -  28 °С,  или  отсутствуют
совсем (чаще у возбудителя псевдотуберкулеза).  Если  такую  чашку
дополнительно инкубировать при температуре 26 - 28  °С  в  течение
                                                                +
24 - 48  ч,   на  среде  вырастут  обычного  размера  колонии  П -
иерсиний. Иногда после инкубирования при температуре 37 °С  наряду
с мелкими вырастают крупные колонии  (до 30  -  50%), образованные
клетками иерсиний, утративших плазмиду. При температуре 26 - 28 °С
на  кальцийдефицитной  среде  размеры  колоний  такие же,  как  на
обычном питательном агаре.

У бесплазмидных иерсиний (отрицательный результат) рост при двух температурах такой же, как на обычных средах.



Методика определения температурозависимой морфологии колоний

Вирулентные иерсинии при определенных условиях образуют на обычном питательном агаре характерные колонии.

В качестве плотной среды для теста температурозависимой морфологии колоний используют агар АГВ. Посев производится так же, как при определении кальцийзависимости; учет результатов - через 24 - 48 ч визуально или с помощью лупы. Диаметр колоний измеряют с помощью окуляр-микрометра.

                              +
    При  температуре  37 °С  П -иерсинии   образуют  более  мелкие
(в  1,5 - 3,0  раза),   чем  при   26  -  28  °C,  колонии,  менее
                                                        -
прозрачные,  желтоватые,   зернистые,  выпуклые;   у   П -иерсиний
колонии крупнее, чем при 26 - 28  °С,  или  такие  же, прозрачные,
более плоские, голубоватые, маслянистые. При высокой достоверности
различий средних диаметров колоний (t не менее 4),  полученных при
Страницы документа: 1 2

Комментарии
Комментирование через социальные сервисы Facebook и Вконтакте:

Курсы валют ЦБР

10.08.201711.08.2017
EUR70.418370.2677
USD59.961159.9298
UAH2.330622.3319
KZT0.180180.180324
GBP77.985477.6930
CNY8.977838.99725
JPY0.5464170.54494

Интересные новости